Identification of regulatory mechanisms of CYP24A1 expression and VDR activity in Lung cancer
폐암에서 CYP24A1 발현 기전 및 VDR활성 조절 기전 규명 연구
초록/요약
LKB1 (STK11) is a tumor suppressor gene as a serine/threonine kinase that regulates various biological functions such as transcriptional control of cells, cell growth, cell polarity, and cell mobility. LKB1 is mutated about 17 to 30% in lung cancer cells, the effect of treatment with the LKB1 mutation is still insufficient. Therefore, we tried to discover new signal transduction regulated by LKB1. We found in a preliminary research that the tumor suppressor gene LKB1 regulate CYP24A1 expression. CYP24A1 (Cytochrome P450 family 24 subfamily A member 1) is an enzyme that catabolizes vitamin D, 1,25-dihydroxyvitamin D3 (calcitrol). which has various biological functions in the body, and is essential for vitamin D signaling. But recently, CYP24A1 overexpression was reported on many lung cancer cancers as oncogene. Increased CYP24A1 offsets the anti-cancer mechanism of VDR, but it is speculated that the mechanism of regulation of CYP24A1 expression is not yet clear. In this paper, we identified increase in aerobic glycolysis in LKB1 mutant type cells compared to LKB1 wild type. The resulting evidence suggests that lactate by aerobic glycolysis contributes to the increase of CYP24A1 expression. Conversely, the glucose starvation capable of inhibiting glycolysis reduced CYP24A1 expression, consistently NaHCO3 and NaOH treatments that induce alkalization also reduced expression of CYP24A1. In addition, low of cytosolic pH by glycolysis plays an important role in acidification of lysosome through V-ATPase, that essential for increasing CYP24A1 expression. Moreover, we suggest that calcium-dependent transcription factors TFEB regulates CYP24A1 expression in lysosomes. Thapsigargin (TG), Tunicamycin (TM), which is well known as an ER stressor, inhibits calcium release to lysosomes along with calcium depletion in ER, decreases function through disruption of lysosome, and increases pH in lysosome, significantly reducing the expression of CYP24A1. Our data suggest that a novel tumor suppressor mechanism of LKB1, the vitamin D metabolic pathway, and an anti-cancer strategy to neutralize acidic tumor microenvironment caused by overexpression of CYP24A1 through elevated lactate in LKB1 mutant cells.
more초록/요약
LKB1(STK11)은 종양 억제유전자로써, 세포의 전사적 제어, 세포의 성장, 세포 극성, 세포 이동성 등 다양한 생물학적 기능을 조절하는 세린/트레오닌 키나아제 이다. LKB1은 폐암세포에서 약 17~30%정도 돌연변이 되어있으며, 아직까지LKB1돌연변이에 의한 치료제의 발굴은 미흡한 상황이다. 따라서 우리는 LKB1에 의해 조절되는 새로운 신호전달을 발굴하고자 하였다. 우리는 예비 연구에서 종양 억제 유전자 LKB1이 CYP24A1 발현에 영향을 미치는 것을 발견했다. CYP24A1(사이토크롬 P450 패밀리 24 하위 패밀리 A 멤버 1)는 비타민 D,1,25-디하이드록시비타민 D3(칼시트리올)을 분해시키는 효소로써 몸에 다양한 생물학적 기능을 가지는 비타민 D 신호 전달에 필수적이다. 그러나 최근 폐암세포에서 높은 CYP24A1 발현이 종양 유전자로 보고되었다. 게다가 CYP24A1의 과 발현은 VDR의 항암 효과를 상쇄한다고 보고되었지만, 아직까지 폐암에서 CYP24A1발현조절 기전은 아직 명확하지 않다. 이 연구를 통해 우리는 LKB1 야생 형과 비교하여 돌연변이 세포에서 호기성 해당과정의 증가를 확인하였고, 그 결과 해당과정으로 인한 젖산의 생성 증가는 CYP24A1 발현의 증가에 기여함을 제시하였다. 반대로 호기성 해당과정을 억제할 수 있는 저포도당 상태는 젖산을 감소시켰으며, 그로 인해 CYP24A1 발현이 감소되었으며, NaHCO3 처리 및 NaOH 에 의한 세포 외 알칼리화 는 CYP24A1 발현을 감소시킴을 확인하였다. 또한 해당과정 증가에 의한 세포질 pH의 감소는 CYP24A1 발현 증가에 필수적인 V-ATPase를 통한 리소좀의 산성화에 중요한 역할을 하며, 우리는 칼슘 의존적 전사 인자인 TFEB가 리소좀 에서 CYP24A1 발현을 부분적으로 조절 함을 밝혀냈다. ER 스트레스 유발 물질로 잘 알려진 Thapsigargin (TG), Tunicamycin (TM)은 ER의 칼슘 고갈과 함께 리소좀으로의 칼슘 방출을 억제하고, 리소좀 붕괴를 통해 기능을 저하시키고, 리소좀의 pH를 증가시켜 CYP24A1의 발현을 현저하게 감소시킨다. 우리는 LKB1의 새로운 종양 억제 메커니즘인 비타민 D 대사 경로에서 비타민 D분해 효소인 CYP24A1의 과발현으로 인한 내성 폐암 세포에서 산성 종양 미세 환경을 중화시키는 항암 전략을 제시한다.
more목차
Ⅰ. INTRODUCTION 1
Ⅱ. MATERIALS AND METHODS 4
A. Cell culture and Reagents 4
B. Quantitative real-time -PCR 4
C. Luciferase assay 5
D. Western blot 5
E. Lactate assay 6
F. Glucose Measurement 6
G. pH Measurement 6
H. Immunostaining 6
I. Lysosomal pH measurement 7
J. Fractionation 7
K. Colony forming assay 7
Ⅲ. PRELIMINARY RESEARCH 8
Ⅳ. RESULTS 10
A. LKB1 regulates the expression of CYP24A1 through glucose metabolism and pH regulation 10
B. Glucose starvation decrease the expression of CYP24A1. 15
C. Alkalization decrease the expression of CYP24A1 18
D. Regulation of CYP24A1 expression by lysosome acidification. 20
E. Activation of TRPV4 calcium channel by acidosis regulates the expression of CYP24A1 24
F. Lysosomal acidification regulates the expression of CYP24A1 via TFEB downregulation. 27
G. ER stress regulates the expression of CYP24A1 by lysosome function and degradation. 32
H. Neutralization of the acidified tumor environment inhibits colony formation. 35
Ⅴ. DISCUSSION AND CONCLUSION 38
Ⅵ. SUMMARY 40
Ⅶ. REFERENCE 41
국문요약 45
