cGAS NLS2 부위의 새로운 기능
Novel roles of NLS2 motif of cGAS
- 주제(키워드) cGAS , cGAMP , NLS , innate immune system
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 이재호
- 발행년도 2020
- 학위수여년월 2020. 8
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 의생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000030156
- 본문언어 한국어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Cyclic GMP-AMP synthase (cGAS)는 세포 외부 혹은 내부의 스트레스에 의해 세포질에 노출된 이중 가닥 DNA를 인식해 선천성 면역 시스템을 활성화시킨다. cGAS는 주로 세포질에 위치하는 것으로 알려져 있으나, 방사선에 의한 DNA 손상 시 nuclear localization sequence(NLS)에 의해 cGAS가 핵 내 위치해 DNA 복구를 저해한다고 밝혀졌으며, 유사 분열 시 핵막의 붕괴로 노출된 염색체를 cGAS가 인식한다고 보고되었다. 본 연구에서도 면역세포화학염색과 세포분획 실험 결과 cGAS가 세포주기 과정 동안 G1기에서는 핵 내에 주로 존재하나 S기와 G2기를 거치면서 세포질로 주 위치가 변하는 걸 확인하였다. 핵 내 cGAS의 의미를 밝히기 위해 NLS를 부착한 cGAS를 과발현하고 IRF3의 활성화 및 ISG56 발현 변화를 확인한 결과, 세포 내 위치와 상관없이 면역 신호가 핵에 위치된 cGAS에 의해 활성화됨을 보였다. 반대로, 본래 존재하는 NLS를 결함 시킨 cGAS를 과발현해 cGAS의 기능을 관찰한 결과, NLS2가 결함 된 cGAS는 핵으로 이동하지 않을 뿐 아니라, p-IRF3신호의 소실과 cGAS 단백질 발현이 감소됨을 관찰하였다. cGAS inactive mutant(E225A/D227A)는 단백질 발현 감소를 초래하지 않았으며, NLS2가 제거된 자리에 SV40 large T antigen의 NLS를 삽입한 경우에는 핵에 위치함에도 불구하고 단백질의 발현이 감소되는 것을 보아 단백질의 감소가 촉매 기능의 상실이나 핵에 진입이 불가하기에 초래된 것이 아니라 NLS2 부위의 결함 자체가 cGAS 단백질의 감소를 유도함을 확인하였다. 더 나아가, cGAS 단백질 감소의 기전을 분석한 결과, proteasome degradation inhibitor(MG132)처리에 NLS2 결함으로 감소된 cGAS 단백질이 회복됨을 보아 proteasome-dependent degradation이 관여됨을 확인하였다. 추가적으로 유비퀴틴 분석을 하였을 때 NLS2가 결함 된 cGAS에서 poly-ubiquitination 정도가 cGAS WT에 비해 증가돼있음을 관찰하였다. 위 결과 들은 cGAS의 NLS2모티프가 세포 내 위치를 제어할 뿐만 아니라 단백질의 효소 활성 및 단백질 안정화를 제어하는 새로운 기능을 갖고 있음을 시사한다.
more초록/요약
Cyclic GMP-AMP synthase (cGAS) recognizes double-stranded DNA exposed to cells by extracellular or internal stress and activates the innate immune system. Although the main intracellular localization of cGAS is widely known as the cytosol, there has been reports documented its localization in the nucleus. In irradiation-induced DNA damage, nuclear localized cGAS inhibits DNA repair, and cGAS recognizes chromosomes exposed by the breakdown of nuclear envelope during mitosis. In this study, I confirmed that cGAS changes its intracellular localization during the cell cycle, i.e., mainly in the nucleus at G1 phase, but in the cytosol at S and G2 phases. I tried to figure out the role of nuclear cGAS by either artificially localize it in the nucleus, or prevent its entry into nucleus, and checked whether it is functional by monitoring the cGAS-STING-IRF3 signaling pathway (including ISG56 expression). As a result of observing the signal activity by attaching NLS and overexpressing cGAS, it was shown that immune signals were activated by the cGAS irrespective with its intracellular localization. Interestingly, NLS2-mutant cGAS lost p-IRF3 expression, and showed the decreased in cGAS protein level. I confirmed that the decrease of cGAS protein was due to mutation of NLS2 itself, but not by its loss of catalytic function using catalytically-inactive mutant of cGAS(E225A/D227A) or by its inability to enter into the nucleus using NLS2-deleted cGAS with NLS from SV40 large T antigen. The proteasome inhibitor (MG-132), but not the Bafilomycin A1, abolished the decrease of cGAS protein, strongly suggesting the involvement of ubiquitination. It was observed that the degree of poly-ubiquitination was increased in NLS2-mutant cGAS compared to the cGAS control group. The results suggest that NLS2 of cGAS is a major motif of cGAS not only controls the intracellular localization but also the protein’s enzymatic activity as well as protein stability.
more목차
Ⅰ 서론 1
Ⅱ 실험재료 및 방법 5
A 항체 5
B 세포주 배양 5
C Transfection experiment and constructs 5
D Cell synchronization 6
E 면역세포형광염색법 6
F Western blot analysis 7
G Reverse transcriptional polymerase chain reaction 7
H 세포분획법 8
I cGAMP ELISA 8
J Ubiquitination assay 8
K Cycloheximide 처리 9
L 통계적 분석 9
Ⅲ 결과 10
A 세포주기에 따른cGAS의 세포 내 위치 변화 10
B Nuclear cGAS가 cGAS-STING 경로에 미치는 영향 13
C NLS 모티프 결함에 의한 cGAS-STING 신호 영향 16
D NLS2 결함은 cGAS 단백질 stability를 저해 22
E NLS2가 proteasome이 매개된cGAS 단백질 분해를 조절 27
Ⅳ 고찰 31
Ⅴ 결론 33
참고 문헌 34
