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대장균에서 Yarrowia lipolytica의 알코올 탈수소 효소의 수용성 발현 및 특성화

Soluble expression and characterization of alcohol dehydrogenases from Yarrowia lipolytica in Esherichia coli

초록/요약

본 연구는, 산업-바이오 기술을 이용하여 폴리아마이드1212 생성에 필요한 C12 장쇄 알데하이드를 C12 장쇄 알코올로부터 생성하는 것이 이번 실험의 목적이다. 장쇄 알데하이드를 생성하기 위해서 Yarrowia lipolytica가 가지고 있는 alcohol dehydrogenase 효소를 클로닝 하였다. Y. lipolytica는 oleaginous yeast이며 식물성 오일로부터 얻은 fatty alcohol 및 fatty alkane 생물전환이 가능한 균주로 알려져 있다. 이것은 12종류의 Alk(Alkane) monooxygenase를 가지고 있으며 ω-위치에 fatty alkane을 산화하는 능력을 가지고 있다. 특히 ω-위치에서 fatty alkane의 산소작용화는 매우 흥미로운 산화대사물을 생성하며 폴리우레탄, 폴리아마이드와 같은 다양한 바이오폴리머 단량체로 추가로 전환될 수 있다. 이를 위해서는 산화가 매우 중요하다. 가장 중요한 산화 효소 중 하나는 ω-hydroxy fatty acid를 ω-aldehyde fatty acid로 전환할 능력을 가진 alcohol dehydrogenase이다. 그러나 Y. lipolytica ADH에 대한 정보는 많지 않다. 따라서, 이 연구에서, Y. lipolytica에서 ADH를 클로닝하고 대장균에서 발현시켰다. 하지만 ADH가 대장균 유래 유전자가 아닌 효모 유전자에서 가져와 발현의 어려움이 있었다. ADH 효소를 soluble하게 만들어 주기 위해서, 유도제의 농도, 분자 샤페론과의 공동발현, auto-induction과 같은 여러 최적화 전략을 사용하였다. 그 중에서도 샤페론은 부분적으로 insoluble 형태를 soluble 형태로 전환시키고, 실험에서 dodecanol을 dodecanal로 산화시키기 위한 도움을 줄 수 있었다. 5개의 Y. lipolytica ADH중에서 ADH2 효소가 가장 효소활성이 좋았다. 이를 발현한 대장균 세포는 dodecanol의 전-세포 생물전환 과정에서 14.77 ± 7.15 mg/L(BL21기준)의 dodecanal을 얻을 수 있었다.

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목차

제 1장. 서론
제 1절. 산업-바이오 기술
제 2절. Yarrowia lipolytica
제 3절. 효모 유전자를 대장균에서 발현
제 2장. 실험재료 및 방법
제 1절. Alcohol dehydrogenases의 발현을 위한 plasmid 구축 준비
제 2절. Alcohol dehydrogenase들의 발현
제 3절. Alcohol dehydrogenase들의 soluble expression
제 4절. 생물전환반응에서의 ADH의 적용
제 5절. GC 측정
제 6절. 기질로서 1-dodecanol을 사용한 ADH의 in-vitro 활성측정
제 3장. 실험결과
제 1절. Alcohol dehydrogenase 스크리닝
제 2절. 1-dodecanol의 생체전환반응에 대한 반응
제 3절. 다양한 방법들을 사용한 alcohol dehydrogenase들의 발현
제 4절. 다양한 IPTG 농도에 따른 ADH들의 soluble 발현
제 5절. 분자 샤페론의 각 각 다른 inducer의 농도에 따른 ADH들의 soluble 발현
제 6절. 최적화된 조건으로 인한 ADH들의 soluble 발현
제 7절. 가장 활성이 좋은 ADH 효소 선별
제 8절. pH, 양이온에 따른 전-세포 생물전환반응의 최적화 조건
제 9절. 최적화된 조건으로 진행한 전-세포 생물전환반응
제 10절. In-vitro(생체 외) 효소활성 측정
제 4장. 결론
참고문헌
Abstract

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