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Dendropanax morbifera Extract 및 Antimicrobial Hexapeptides에 의한 Staphylococcus aureus의 Biofilm 환경에서 항균 효과에 관한 연구

초록/요약

본 연구에서는 gram-positive이면서 피부 감염 및 폐렴, 수막염과 같은 질병을 유발하는 가장 흔한 병원균 중 하나인 Staphylococcus aureus을 대상으로 하여 직접적인 항균 효과가 있는지 확인하였으며, 항생제 내성과 더불어 미생물의 제어를 어렵게 하는 biofilm 측면에서 연구를 진행하였다. 우선, 동남아시아와 한국의 제주도에 자생하는 식물인 황칠나무(Dendropanax morbifera) 잎 추출물을 용매 극성에 따라 DPL1, DPL2, DPL3, DPL4, DPL5로 명명하여 사용하였다. 또한, antimicrobial peptides(AMPs)는 박테리아, 곰팡이, 원생생물, 바이러스에 대한 광범위한 항생제 활성을 가진 작은 펩타이드이다. AMPs에서 높은 항균 활성을 위해서 최소한 6개의 아미노산이 필요하며, 10개의 hexapeptides 후보를 사용하여 항균 활성 실험을 진행하였다. 황칠나무의 잎 추출물에 대한 항균 활성을 실험한 결과, 비극성 용매인 n-haxane에 의해 분획된 DPL1 추출물의 처리가 살아있는 세포 수를 측정하였을 때 대상 균주의 생장 억제를 보였으며, top agar assay 실험 결과를 통해서 pH와 온도에 따른 변화를 확인하였으며, DPL1 추출물의 농도에 따른 세포의 사멸을 측정하였을 때, 농도 의존적으로 유의미한 항균 효과를 확인하였다. 또한, SEM image 분석을 통해서 DPL1 추출물의 처리가 S. aureus의 외형 변화를 유도하는지 관찰하였다. 다음으로, 단일 세포들에 대한 높은 항균 효과를 확인하였으므로, S. aureus의 biofilm 환경에서 DPL1 추출물의 항균효과를 확인하였다. 우선, DPL1 추출물을 biofilm에 처리한 후 생존 능력을 측정하기 위해서 resorufin assay를 진행하였고, 살아있는 세균을 확인하기 위해서 단일 집락의 수를 측정하였다. 두 실험 모두 유사한 경향성을 보였으며, 물질의 처리 시간과 처리 농도가 증가할수록 더 높은 항균 효과를 확인하였다. Biofilm 형성 초기 단계에서 일부 박테리아는 운동성의 차이를 이용하므로, swimming과 swarming motility assay를 통해서 관찰하였다. 또한, Crystal violet staining을 진행하여 biofilm의 형성 과정 동안에 두께 변화를 관찰하였다. 형광 현미경과 공초점 레이져 스캐닝 현미경(CLSM)을 통해서 biofilm을 관찰하였을 때, biofilm 표면의 세포의 생장 억제 뿐만 아니라 biofilm 내부 세포까지 영향을 줄 수 있음을 확인하였다. SEM image 분석을 통해서 DPL1 추출물의 처리는 biofilm 사이를 끼어들어가면서 손상을 입은 세포나 세포의 잔해의 응집 유도를 관찰하였다. 더불어, 항생제와의 시너지 효과를 확인하기 위하여 resorufin assay, LIVE/DEAD bacterial viability assay를 진행하였다. 실제로 항생제와 DPL1 추출물을 단독으로 처리하였을 때보다 조합 처리하였을 때 더 높은 항균 효과를 보였으며, 낮은 농도의 항생제와 DPL1 추출물을 조합 처리하였을 때에도 항균 효과 유지하였다. Antimicrobial hexapeptides(AMPs)는 S. aureus 균주에서 가장 많은 종류의 AMPs에의한 항균효과를 확인하였으며, 농도와 시간에 따른 항균효과가 가장 효과적인 것을 확인하였다. S. aureus를 표적 균주로 하여 직접적인 생장억제 뿐만 아니라 biofilm 내에서의 미생물 제어가 기대되며, resorufin assay와 LIVE/DEAD bacterial viability assay을 통해서 DPL1 추출물보다 더 뛰어난 항균 효과를 확인하였다. 이러한 결과를 종합하여 볼 때, 황칠나무 잎의 추출물과 hexapeptide의 처리는 병원균의 성장 억제 뿐만 아니라 그들이 형성하는 biofilm 환경에서 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다.

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목차

국문요약 i
목차 iii
List of Figures vi
List of Table ix
Ⅰ. 서론 1
Ⅱ. 재료 및 방법 3
2.1. 시약 3
2.2. 박테리아 균주 및 액체 배양 조건 3
2.3. 박테리아 균주 및 Biofilm 배양 조건 3
2.4. Dendropanax morbifera추출물 4
2.5. Top agar assay 4
2.6. DPL1 추출물의pH, 온도 안전성 확인 5
2.7. DPL1 추출물의 항균효과 검정 5
2.8. Resorufin assay를 이용한 Biofilm 내 세균 생존 능력 평가 5
2.9. Crystal violet staining 6
2.10. Motility assay : Swimming and swarming motility 6
2.11. LIVE/DEAD bacterial viability assay 7
2.12. Confocal Laser Scanning Microscopy(CLSM) 7
2.13. Scanning Electron Microscopy(SEM) 8
2.14. 통계분석 8
Ⅲ. 결과 10
3.1. Dendropanax morbifera추출물의 분획 10
3.2. Dendropanax morbifera추출물이 S. aureus의 성장 억제 효과 10
3.2.1. 전체 Dendropanax mobifera분획물이 S. aureus성장에 미치는 영향 10
3.2.2. Top agar assay 11
3.2.3. Dendropanax morbifera추출물이 S. aureus의 성장에 미치는 영향 11
3.2.4. Scanning Electron Microscopy(SEM) 12
3.3. DPL1 추출물의S. aureus에 biofilm 환경에서의 항균 효과 검증 12
3.3.1. S. aureus biofilm 환경에서의 DPL1 추출물 처리가 미치는 효과 12
3.3.2. S. aureus biofilm 형성 후, 처리 시간에 따른 효과 13
3.3.3. Motility assay : swimming and swarming motility 14
3.3.4. DPL1 추출물이 biomass에 미치는 효과 확인 14
3.3.5. LIVE/DEAD Bacterial Viability assay 15
3.3.6. DPL1 추출물이 S. aureus biofilm 내부의 침투 효과 관찰 15
3.3.7. Scanning electron microscopy(SEM) 16
3.4 S. aureus biofilm에 대한 DPL1 추출물과 kanamycin의 조합처리 17
3.4.1. 항생제가 S. aureus biofilm에 미치는 영향 17
3.4.2. Kanamycin 처리가 S. aureus 생장에 미치는 효과 17
3.4.3. DPL1 추출물과 kanamycin 조합처리가 S. aureus생장에 미치는 효과 18
3.4.4. DPL1 추출물과 kanamycin 조합처리가 S. aureus biofilm에 미치는 효과 18
3.4.5. LIVE/DEAD Bacterial viability assay에 의한 DPL1 추출물과 kanamycin의 세포 활성 측정 19
3.5. Hexa-peptides가 S. aureus에 대한 항균 효과 검정 42
3.6. Hexa-peptides가 S. aureus biofilm에 미치는 효과 검정 42
3.6.1. Hexa-peptides처리가 S. aureus biofilm에 미치는 변화 측정 42
3.6.2. Hexa-peptides의 농도 변화에 따른 S. aureus biofilm에 미치는 효과 검정 43
3.6.3. Hexa-peptides의 시간 변화에 따른 S. aureus biofilm에 미치는 효과 검정 44
3.6.4. LIVE/DEAD Bacterial Viability assay 44
3.6.5. Hexa-peptides가 S. aureus biofilm 내부의 침투력 효과 관찰 45
Ⅳ. 고찰 55
Ⅴ. 참고문헌 60
Ⅵ. 영문요약 63

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