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초파리 생체시계에서 AMPK의 역할

Roles of AMPK in Drosophila circadian clock

초록/요약

생체시계는 외부환경에 맞추어 생명체의 행동과 생리적 변화를 조절한다. 초파리의 생체시계는 drosophila CLOCK (dCLK)과 PERIOD (PER) 단백질로 구성된 Transcriptional Translational Feedback Loop (TTFL)로 작동된다. dCLK은 전사활성자로 CYCLE (CYC)와 이형이량체를 이루어 per와 timeless (tim)의 전사를 촉진하고, 번역된 PER와 TIM 단백질도 서로 결합하여 CLK/CYC 복합체의 활성을 억제함으로써 per와 tim 자신의 발현을 저해한다. 그 중 dCLK의 전활성 조절 기전에 대해서는 아직 밝혀지지 않은 부분이 많다. 따라서 이번 연구에서는 먼저 dCLK 복합체 (dCLK complex)를 분리하여 구성 단백질들을 동정하고 생체시계에서 구성 단백질의 역할을 분석함으로써 dCLK의 활성 조절 기전을 이해하고자 하였다. dCLK 복합체에 속하는 단백질들을 확인하기 위해 Tandem Affinity Purification (TAP)을 이용하여 dCLK 복합체를 분리하고 질량분석법(Mass Spectrometry)으로 동정하였다. 검출된 단백질들 중에서 우리는 AMP-activated protein Kinase (AMPK)의 gamma subunit에 집중하였다. dCLK과 AMPKγ subunit이 상호작용하는지 Schneider2 cell (S2)에서 상호 면역침전법 (Co-Immunoprecipitation)을 실시해 본 결과 dCLK은 AMPK holo-enzyme의 각 subunit 즉, α, β 또는 γ subunit과 모두 상호작용 함을 확인하였다. 생명체의 물질대사에서 에너지 센서 (energy sensor)로 알려진 AMPK가 초파리의 생체시계에는 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 AMPK의 각 subunit을 RNA 간섭현상 (RNAi interference;RNAi)을 이용하여 tim expressing cells에서 Knockdown (KD)한 후 Drosophila Activity monitoring system (DAM system)을 이용하여 초파리의 운동량을 측정하고 생체리듬을 분석하였다. 그 결과 AMPKα KD 초파리는 rhythmicity가 감소하고 생체리듬 주기가 약간 증가하였고, AMPKβ KD 초파리는 생체리듬 주기가 길어졌으며, AMPKγ KD 초파리는 rhythmicity가 완전히 사라지는 arrhythmic 패턴을 보였다. 이 결과는 AMPK의 활성이 생체시계의 정상적인 작동에 필수적임을 의미하는 것이다. AMPK RNAi의 효과를 확인하기 위해 AMPKα, β, γ 각 subunit의 발현을 저하시킨 초파리에서 AMPKα 양을 확인하였더니, AMPKα KD와 AMPKγ KD에서 AMPKα의 양이 감소하였으며 그 정도는 AMPKγ KD에서 더 심하였다. AMPK가 dCLK에 어떠한 작용을 하는 지 확인하기 위해 AICAR를 처리하여 AMPK를 활성화 시킨 S2 세포에서 dCLK을 western blotting으로 살펴 본 결과 dCLK의 mobility가 증가되는 것을 확인하였다. 이는 AMPK의 활성으로 인해 dCLK의 인산화가 감소된 것이 원인일 것으로 생각된다. AMPK KD 초파리의 달라진 생체리듬이 생체시계 단백질에서도 보이는 지 확인하기 위해 12h:12h light:dark cycle에 적응 시킨 초파리의 머리에서 단백질액을 얻어 AMPKγ KD에서는 PER 단백질을, AMPKα KD에서는 dCLK 단백질을 western blotting으로 확인했다. 그러나 PER와 dCLK 단백질 패턴은 대조군과 크게 다르지 않았다. 그렇다면 생체시계를 조절하는 생체시계 신경 (circadian clock neurons)에서는 어떠한 지 확인하기 위해 초파리의 뇌를 분리하여 면역조직화학 (immunohistochemistry)을 실시하였다. 그 결과 대조군과 다르게 AMPKγ KD 초파리의 Large-Ventral Lateral Neurons (l-LNvs)와 Dorsal Lateral Neurons(LNds), 그리고 Dorsal Neurons(DNs)에서 PER가 감소하였고 Small-Ventral lateral Neurons (s-LNvs)에서는 PER와 PDF가 염색되지 않았다. 뿐만 아니라 s-LNv에서 DNs으로 뻗어 나오는 neural projection이 관찰되지 않음을 확인하였다. s-LNv의 neural projection이 관찰되지 않는 현상은 ClkJrk 돌연변이에서 발견된 것과 같다. tim 발현세포에서 AMPK 발현을 저하시킨 초파리에서와 같이 pdf 발현세포에서 AMPKα 또는 γ의 발현을 저하시킨 초파리에서도 주기가 길어지거나 생체리듬이 약해지는 결과를 확인하였다. 반면 c929-gal4를 이용하여 l-LNvs와 몇몇 peptidergic neuron에서 AMPKγ의 발현을 저하시킨 초파리는 rhythmicity를 절반정도 회복하고 정상 주기를 가졌다. 이는 s-LNvs에서 AMPK의 발현이 생체리듬의 유지에 필수적이라는 것을 나타낸다. 또한 성체 시기에만 특이적으로 tim 발현세포에서 AMPKα 또는 γ의 발현을 저하시킨 초파리에서도 생체리듬의 변화가 관찰되었는데, AMPKα KD의 경우는 rhythmicity가 약간 감소하고 주기가 길어졌고, AMPKγ KD의 경우는 rhythmicity가 현저히 감소하였다. 이 결과는 발달과정에서 AMPK의 기능과는 별개로 성체에서의 AMPK의 활성이 locomotor activity rhythm에 중요함을 말해준다. 본 연구에서는 AMPK가 초파리의 생체시계 작동에 관여함을 입증하였고, 성체의 생체시계 뉴런에서 locomotor activity rhythm을 만드는데 AMPK의 기능이 필수적임을 밝혔다. 그러나 AMPK KD 초파리의 생체리듬 변화의 원인이 AMPK 발현 저하로 인한 s-LNvs의 부재 때문인지, dCLK을 포함한 TTFL의 변화 때문인지에 대한 후속연구가 진행되어야 할 것으로 생각된다.

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목차

국문요약 ⅰ
차례 ⅳ
그림 차례 ⅵ
표 차례 ⅶ
Ⅰ. 서론 1
Ⅱ. 재료 및 방법 5
A. Schneider 2 (S2) 세포에서 발현시키기 위한 plasmid 5
B. S2 세포의 배양과 transfection 6
C. 형질전환 초파리 6
D. Locomotor Activity Monitoring System 8
E. 초파리 entrainment와 수확 8
F. 단백질액 추출 (lysis) 9
1. S2 세포에서 단백질액 추출 9
2. 초파리 머리에서 단백질액 추출 9
G. Immunoblotting (western blotting) 10
H. 면역침강법 (ImmunoPrecipitation; IP) 12
1. AMPKγ 와 dCLK 또는 dCLKΔ657-707 간의 상호작용 확인 12
2. dCLK과 AMPK α, β, γ subuit 간의 상호작용 확인 13
I. Tandem affinity purification (TAP) 15
J. 면역조직화학 (Immunohistochemistry) 16
Ⅲ. 결과 18
A. S2 세포에서 dCLK은 AMPK와 결합한다. 18
B. tim 발현 세포에서 AMPK의 발현이 저하된 초파리의 생체리듬 분석 21
C. AMPKα와 γ KD 초파리에서 AMPKα 단백질의 양이 감소하였다. 24
D. AICAR를 처리한 S2 세포에서 western blotting으로 본 dCLK은 시간에 따라 mobility가 증가한다. 26
E. AMPK KD 초파리 머리에서 얻은 단백질액의 dCLK과 PER 양상에서는 유의미한 차이가 발견되지 않았다. 28
F. AMPKγ KD 초파리의 LNvs, LNds, DNs에서 PER의 양이 감소한다. 30
G. AMPKγ 초파리에서 s-LNvs의 neural projection이 보이지 않는다. 32
H. pdf 발현세포에서 AMPK의 발현이 저하된 초파리의 생체리듬 분석. 34
I. tim 발현 세포에서 성체에서만 AMPK의 발현을 저하시킨 초파리의 생체리듬 분석. 40
Ⅳ. 고찰 33
Ⅴ. 결론 47
참고문헌 49
ABSTRACT 54

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