Bacillus gelatini 로부터 열 안정성 esterase의클로닝과 특성 규명
Cloning and Characterization of Thermostable Esterase from Bacillus gelatini
- 발행기관 아주대학교
- 발행년도 2014
- 제출일 2013-01-31
- 학위수여년월 2014. 2
- 학위명 석사
- 학과 일반대학원 분자과학기술학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000016403
- 본문언어 한국어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Ketoprofen [(R, S)-2-(3-benzoylphenyl) propinic acid]은 비 스테로이드 항염증약 NSAID (nonsteroidal anti-inflammatory drug)으로서 염증을 가라앉히는데 널리 사용되며, 관절염이나 화상 그리고 월경의 과다한 분비 및 체열을 경감시키는 데 쓰인다. 특히 항염증 활성은 주로 (S)-ketoprofen에서 나타나며, (R)-ketoprofen은 위장계의 부작용을 나타낼 수 있다. 따라서 순수한 (S)-ketoprofen을 생산하기 위하여 화학적 방법과 생물학적 방법이 주로 사용된다. (S)-ketoprofen을 생산할 때 사용되는 recemic-ketoprofen ethyl ester를 잘 녹이기 위하여 높은 온도가 필요하며, 이에 따라 높은 온도에도 활성을 유지할 수 있는 thermostable esterase가 필요한다. 본 실험의 목적은 다양한 문헌 및 특허를 통해 다양한 종류의 호열성 균주를 선별하여 높은 온도에서 ketoprofen ethyl ester를 (S)-ketoprofen으로 가수 분해할 수 있는 thermostable esterase를 찾는 것이다. 선별된 Bacillus gelatini의 genomic DNA를 추출하고 제한효소로 처리한 후 pQE30과 ligation하여 Escherichia coli XL1 blue에 transformation한다. 정제된 esterase의 특성과 ketoprofen ehyl ester에 대한 반응을 HPLC를 통해 측정한다.
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목차
국문 요약 I
I. 서 론 1
1. 연구 배경 1
2.Ketoprofen의 정의 3
3. Esterase의 정의 및 역할 5
4. 연구 목적 7
II. 재료 및 방법 8
1. 실험 재료 8
2. 실험 방법 10
2.1 Ketoprofen Ethyl Ester의 합성 10
2.2 Ketoprofen 배지에서의 esterase positive strain의 선별 11
2.3 열 안전성이 높은 Esterase gene의 cloning 12
2.4 1-naphtyl acetate 와 Fast Blue B Salt를 이용한 activity staining. 14
2.5 Esterase의 발현 및 정제 15
2.6 SDS PAGE 17
2.7 단백질의 농도 측정 19
2.8 Ketoprofen ethyl ester를 이용한 esterase의 활성측정 21
2.9 Esterase의 최적 온도 측정 23
2.10 Esterase의 최적 pH 측정 23
2.11 Esterase의 최적 계면활성제 농도 측정 24
2.12 Esterase의 열 안정성 측정 24
2.13 유기 용매의 Esterase에 대한 영향 측정 25
2.14 계면활성제의 Esterase에 대한 영향 측정 25
II. 결과 26
1. Esterase positive strain의 선별 26
2. Esterase gene의 cloning 및 activity staining 확인 28
3. Esterase의 sequence 결과 및 size 측정 31
4. Esterase의 최적 온도 측정 34
5. Esterase의 최적 pH 측정 36
6. Esterase의 최적 계면활성제 농도 측정 38
7. Esterase의 열 안정성 측정 40
8. 유기용매의 영향 측정 42
9. 계면활성제의 영향 측정 45
IV. 결론 47
Reference 49
Abstract 51
