신규 미백제 합성 및 트리블록 공중합체의 약물 전달체 연구
Studies on the synthesis of a new whitening agent and its efficacy with the novel carrier system of triblock copolymer
초록/요약
신규 미백제를 개발하기 위하여 다이올(diol)화합물과 아실클로라이드(acyl chloride)를 에스테르화 반응을 하여 알킬 다이에스터(alkyl diester) 유도체 9종, 싸이클로헥산 다이에스터(cyclohexane diester) 유도체 15종, 벤젠 다이에스터(benzene diester) 유도체 15종과 싸이클로헥산 다이아마이드(cyclohexane diamide) 유도체 15종 등 54종의 유도체를 합성 하고 구조를 확인하기 위하여 1H-NMR과 FT-IR을 이용하여 구조를 확인 후 미백 유도체의 구조독성관계(STRs)와 구조활성관계(SARs)를 평가하기 위하여 mushroom tyrosinase 저해율과 B16F10 mouse melanoma 세포를 이용하여 세포독성을 평가하였다. 첫 번째, Alkyl diester 유도체의 경우 아실기의 탄소수가 10개로 동일하고 다이올의 탄소수가 증가하는 구조와 다이올의 탄소수 6개로 동일하고 아실기의 탄소수가 증가하는 화합물에서는 mushroom tyrosinase 저해율과 세포독성이 감소하였다. 그러나, 아실기의 탄소수가 10개, 다이올의 탄소수 4개로 고정 후 에스터 결합의 간격을 벌어질 경우 mushroom tyrosinase 저해율은 상승하고 세포독성은 증가하는 구조적 특징을 보였다. 또한, 아실기의 구조가 직쇄(linear)인 경우 보다는 분직쇄(branch)에서 좀 더 낮은 세포독성을 확인하였다. 두 번째, Cyclohexane diester 유도체는 아실기의 탄소수가 8개인 경우를 제외하고 아실기의 탄소수가 증가할수록 mushroom tyrosinase 저해율이 감소하였다. 그러나, 세포독성의 경우 1,2-와 1,4-diester에서는 아실기의 탄소수가 증가하면 세포독성이 낮아지고 1,3-의 구조에서는 반대로 증가하였다. 세 번째, Benzene diester 유도체의 1,2-diester 화합물은 아실시의 탄소수 8개까지는 mushroom tyrosinase 저해율이 상승하다가 그 이상에서는 감소하였고 세포독성은 연속적으로 증가하였다. 1,3-diester 화합물의 경우 1,2-diester 화합물의 반대 결과를 확인하였고 1,4-diester 화합물은 1,2-diester와 동일한 경향을 보였다. 네 번째, Diamide 화합물에서 1,2-diamide 화합물은 치환기의 탄소수가 8개까지는 mushroom tyrosinase 저해율이 감소하다가 다시 상승하였고 세포독성 또한 치환기의 탄소수 8개를 제외하면 증가하였다. 1,3-/1,4-diamide 화합물의 mushroom tyrosinase 저해율과 세포독성은 1,2-diamide 화합물의 반대 결과를 확인하였다. 구조-활성관계 측면에서 B16F10 마우스 멜라노마 세포를 이용한 멜라닌 생성 저해율은 아실기의 탄소수가 증가할수록 저해율도 함께 증가하는 경향을 보였다. 또한, Alkyl diester 유도체 보다는 cyclohexane diester, benzene diester와 cyclohexane diamide와 같이 고리화합물일 경우가 좀 더 우수한 멜라닌 생성 저해율을 보였다. 이를 통하여 1차 선변된 화합물을 B16F10 mouse melanoma와 HM3KO human melanoma 세포를 이용하여 단백질 및 유전자의 발현량을 관찰하여 최종적으로 가장 미백효과가 우수한 1,3-phenylene bis(2-ethyl hexanoate)를 선정하였으며 500μM에서 mushroom tyrosinase 저해율은 5.8±1.1, 세포생존율은 94.2±1.2%, melanin 합성 저해율은 54.18±2.7%였다. 3차원 분자 모델링을 통하여 human tyrosinase에 대하여 화합물 34번이 Lys196, Phe209, Asn226, Ser222 그리고 Val239과 상호작용을 하는 것을 확인하였다. 최종 선정된 1,3-phenylene bis(2-ethyl hexanoate)를 함유하는 나노입자를 제조하기 위하여 기존의 무기촉매 대신 리파아제(Lipase) 계열의 효소(Novozym 435TM)를 사용하여 온화한 조건에서 Methoxy Polyethylene glycol- Polycaprolactone-Methoxy Polyethylene glycol (mPEG- PCL-mPEG)을 분자량별로 합성하였다. 합성된 mPEG-PCL-mPEG 트리블록 공중합체의 물성을 시험하기 위하여 핵자기 공명 분광 분석기, 적외선 스펙트럼, 시차주사 열량측정기 그리고 겔투과 크로마토그래피를 이용하여 분석하였다. 화합물 34번이 로딩 된 mPEG-PCL-mPEG 트리블록 공중합체는 5℃, 25℃, 45℃, 일광 그리고 싸이클링 인큐베이터에서 외관 성상 변화, 입자 크기 분포, 제타 전위 측정 그리고 형광현미경을 이용하여 안정성을 관찰하여 mPEG-PCL-mPEG(3k-3k-3k)를 최종 미백물질 전달체로 선정하였다. 새로운 미백제의 실제 효과를 확인하기 위해 ex-vivo와 in-vivo 실험을 통하여 미백 효과를 평가하였다.
more목차
국문 요약 1
목 차 3
표목차 7
그림목차 8
약어 12
1. 서 론 14
1.1 배경 14
1.1.1 미백 소재의 기술 동향 14
1.1.2 이론적 배경 18
1.2 유도체 합성 23
1.2.1 Diester와 Diamide의 합성 23
1.3 트리블록 공중합체의 합성 25
1.3.1 양친성 유기 초분자 자기 조립체 25
1.3.2 효소 촉매 합성법을 이용한 트리블록 공중합체 28
1.4 효능평가 32
1.4.1 In-vitro test를 통한 효능 평가 32
1.4.2 Ex-vivo test를 통한 효능 평가 32
1.4.3 In-vivo test를 통한 효능 평가 33
1.5 분자설계 기술을 통한 효능 평가 34
1.5.1 Tyrosinase inhibitor 모형 연구 34
2. 재료 및 방법 35
2.1 재료 35
2.2 기기 37
2.3 미백 유도체 38
2.3.1 Alkyl diester 유도체의 합성 38
2.3.2 Cyclohexane diester 유도체의 합성 41
2.3.3 Benzene diester 유도체의 합성 44
2.3.4 Cyclohexane diamide 유도체의 합성 47
2.4 트리블록 공중합체 50
2.4.1 트리블록 공중합체의 합성 50
2.4.2 구조 분석 51
2.4.3 열분석 51
2.4.4 분자량 분석 52
2.5 효능 평가 (vitro) 53
2.5.1 세포주 및 세포배양 53
2.5.2 세포 생존율 측정 53
2.5.3 면역 형광적 세포 관찰 (DAPI-Staining) 53
2.5.4 Mushroom tyrosinase 활성도 측정 54
2.5.5 멜라닌 합성량 측정 54
2.5.6 Western blot 분석 55
2.5.7 RT-PCR 분석 55
2.5.8 Tyrosinase inhibitor 모형 분석 56
2.6 나노입자 58
2.6.1 나노입자의 제조 58
2.6.2 나노입자의 포집 효율 59
2.6.3 나노입자의 외관 경시변화 59
2.6.4 나노입자의 입도 분포 측정 59
2.6.5 나노입자의 제타 전위 측정 60
2.6.6 형광현미경 관찰 60
2.6.7 나노입자가 함유된 화장품의 제조 61
2.7 효능 평가 (vivo) 63
2.7.1 경피 흡수 적용 실험 63
2.7.2 체외 인체 조직 적용 실험 63
2.7.3 인체적용 실험 64
2.8 통계 처리 66
3. 결과 및 검토 67
3.1 미백 유도체 67
3.1.1 Alkyl diester 유도체의 구조 분석 67
3.1.2 Cyclohexane diester 유도체의 구조 분석 68
3.1.3 Benzene diester 유도체의 구조 분석 71
3.1.4 Cyclohexane diamide 유도체의 구조 분석 74
3.2 트리블록 공중합체 77
3.2.1 구조 분석 77
3.2.2 열분석 81
3.2.3 분자량 분석 83
3.3 효능 평가 85
3.3.1 Mushroom tyrosinase 활성에 미치는 영향 85
3.3.2 MTT Assay 90
3.3.3 B16F10 cell에서 멜라닌 합성에 미치는 영향 98
3.3.4 B16F10 cell에서 단백질 발현에 미치는 영향 106
3.3.5 B16F10 cell에서 유전자 발현에 미치는 효과 108
3.3.6 HM3KO cell에서 미백 효과 확인 110
3.3.7 B16F10 & HM3KO cell에서 DAPI-staining 112
3.3.8 Tyrosinase inhibitor 모형에 미치는 영향 114
3.4 나노입자 117
3.4.1 나노입자의 제조 117
3.4.2 나노입자의 포집 효율 117
3.4.3 나노입자의 외관 경시변화 118
3.4.4 나노입자의 입도 분포 측정 122
3.4.5 나노입자의 제타 전위 측정 126
3.4.6 형광현미경 관찰 130
3.5 효능 평가 (vivo) 132
3.5.1 경피 흡수 적용 실험 132
3.5.2 미백 유도체의 체외 인체 적용 실험에서의 효과 133
3.5.3 미백 유도체의 인체 적용 실험에서의 효과 140
4. 결론 143
참고 문헌 145
ABSTRACT 160
부록 162
