병원성 파울러자유아메바 lysate에 의한 Primary rat astrocyte의 염증반응
Inflammatory response of primary rat astrocyte treated with Naegleria fowleri lysate
- 주제(키워드) Naegleria fowleri , astrocyte , inflammatory response , IL-1β , IL-6 , MAPK , NF-κB , AP-1
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 신호준
- 발행년도 2010
- 학위수여년월 2010. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000010567
- 본문언어 영어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Naegleria fowleri, a free-living ameba, was found in diverse habitats throughout the world, and causes an acute, fulminating hemorrhagic meningoencephalitis, called primary amoebic meningoencephalitis (PAME), in healthy children and young adults with a history of recent exposure to polluted freshwater. Infection with N. fowleri is initiated by the introduction of water contaminating organisms into the nasal cavity of the host. Amoeba attachs to the nasal mucosa, migrate along the olfactory nerves, cross the blood-brain-barrier, and enter the brain. Astrocytes, abundant cells of CNS, involve the host’s defense against infection and then produce the inflammatory response. However, the inflammatory responses of astrocyte that is response to N. fowelri are largely unknown up to recently. In this study, to understand microbes from the infected CNS, as well as in the immunopathogenesis of inflammatory diseases, we focus both on how cytokines and immune response can be activated. Using RPA (RNase protection assay) and RT-PCR, we revealed that IL-1β and IL-6 mRNA expression were increased after N. fowleri lysate treatment. IL-6 mRNA expression is more strong than IL-1β. To identify relation between MAPK and expression of inflammatory cytokine, I performed RT-PCR using specific inhibitors. The expression levels of cytokine in response to stimuli were gradually decreased on account of ERK and P38, and JNK inhibitor (ERK inhibitor, U0126; P38 inhibitor, SB202190; JNK inhibitor, SP600125). And all MAPK inhibitors reduced the IL-1β and IL-6 protein levels in ELISA. But, activation of MAPK slightly detected by western blot in N. fowleri lysate-stimulated astrocytes. To find out transcription factor of these cytokine, I was used to transcription inhibitor (AP-1 inhibitor, Tanshinone IIA; NF-κB inhibitor, BAY 11-7082). Although mRNA expression of N. fowleri-induced IL-1β and IL-6 was elevated by MG132, their protein levels were significantly reduced by BAY 11-7082. In addition, experiments though Tanshinone IIA, were down-regulated IL-1β and IL-6 expression. From these results, I considered that both NF-κB and AP-1 related to production of pro-inflammatory cytokine, IL-1β and IL-6. Consequently when primary rat astrocyte treated with N. fowleri lysate, IL-1β, and IL-6 mRNA expression, and secretion elevated, and this process is adjusted through MAPKs, NF-κB, and AP-1. It may be implied that production of pro-inflammatory cytokine are likely to act an important role in the inflammatory response to N. fowleri infection in the CNS.
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ABSTRACT•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• ⅰ
TABLE OF CONTENTS•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• ⅱ
LIST OF FIGURES••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• ••••••••••••••••••••••••••••ⅴ
LIST OF TABLE•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• ••••••••••••••••••••••••••••ⅶ
Ⅰ. INTRODUCTION••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 1
A. Naegleria fowleri••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 1
B. CNS••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 3
C. Cytokine•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 4
D. MAPK•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 5
E. Aim of this study••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 7
Ⅱ. MATERIALS AND METHODS••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 8
A. Astroglial primary cultures•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 8
B. N. fowleri cultures and N. fowleri lysate••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 8
C. RNA isolation•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 8
D. RNase Protection Assay (RPA) •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 9
E. Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) •••••••••••••••••••••••••••••10
F. Cell extraction •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••10
G. Western blot••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••12
H. Measurement of cytokine production•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••12
I. ELISA-based TransAM™ kit for AP-1••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••12
Ⅲ. RESULTS•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 14
A. SDS-PAGE pattern of N. fowleri lysate••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 14
B. mRNA expression of cytokine genes•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 15
C. Suppression of cytokine expression by MAPK inhibitor ••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 18
D. Activation of MAPKs ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 22
E. Effect of MAPK inhibitors on N. fowleri lysate-induced
cytokine production••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 24
F. Suppression of IL-1β and IL-6 mRNA expression
by Transcription factor inhibitor•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 26
G. Suppression of IL-1β and IL-6 production
by Transcription factor inhibitor•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 28
H. Activation of AP-1••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 29
Ⅳ. DISCUSSION••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 31
Ⅴ. CONCLUSION••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 35
REFERENCES•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 36
국문요약••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 48
