ROCK 억제제가 인간배아줄기세포 동결보존에 미치는 영향
The effect of ROCK inhibitor in cryopreservation of human embryonic stem cells
- 주제(키워드) embryonic stem cells , cryopreservation , ROCK inhibitor , freezing , thawing
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 민철기
- 발행년도 2009
- 학위수여년월 2009. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 생명과학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/ajou/000000009514
- 본문언어 한국어
- 저작권 아주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
This study was performed to innovate in the cryopreservation method for human embryonic stem cells. The post-thawing survival rate of human embryonic stem cells has been known around 1% by the conventional slow cooling method following optimization for general cells and murine embryonic stem cells (mESCs), which is performed with single cell dissociation by trypsinazation. Because of this problem, many scientists have reported various methods through modifying the concentration of cryoprotectants or serum in freezing media or changing cooling rate using hESC clump instead of trypsinized single hESCs. Ac-cording to many reports, slow cooling methods can provide 0~70% of hESC survival rate and 37% of undifferentiation rate in maximum, and vitrification, known for the most efficient method, provides 100% of post-thaw survival rate and over 80% of post-thaw undifferentiation rate. Unfortunately, the best vitrification method is not appropriate for massive cryopreservation for regenerative cell therapy because of the small number of storage capability (only 4 to 8 clumps per a straw) and the higher cryoprotectent concentration than other conventional methods. For these reasons, this study attempted to test the differences of survival and undifferntiation rate between ROCK inhibitor-treated group and untreated control group using programmed slow cooling method, which provides bigger storage capacity. It has been known that ROCK inhibitor lift up the survival rate of single-cell-dissociated hESCs in culture. In conclusion, the significant increase was observed in both attachment rate and undifferntiation rate at ROCK inhibitor treatment group; the result is that the mean±S.D. values of control group were 35.194±19.295 and 16.845±18.552 for attachment and undifferntiation rate, and the values of ROCK inhibitor treated group were 45.962±25.873% and 26.505±29.014%, respectively.
more초록/요약
본 연구는 인간배아줄기세포(human embryonic stem cells, hESCs)의 동결 보존 후 매우 낮은 생존률이라는 문제점을 해결하고자 시행되었다. 기존 일반 세포와 설치류 배아줄기세포(murine embryonic stem cells, mESCs)의 동결보존에 널리 사용되고 있는 전통적인 저속 감온 동결법(conventional slow cooling method: 트립신 처리(trypsinazation)에 의해 단일 세포 상태로 분리된 hESC를 얼리는 방법)에 의하면 해동 후 인간배아줄기세포의 생존율이 1% 미만인 것으로 알려져 있다. 이를 보완하기 위해 hES를 단일 세포 상태로 얼리는 대신에 세포 덩어리(clump) 상태로 얼리는 방법으로 여러 방법들이 시도되어 왔는데, 이들은 주로 동결 배지에 첨가하는 동결 보존제나 혈청의 농도에 변화를 주거나 냉각 속도를 달리 하는 등 여러 가지 방법적 개선을 통해 0~70%의 세포생존율과 최고 약 37.5%의 효율이 보고되었다. 이러한 저속 감온 동결법에서 벗어나 유리화 동결법(vitrification method) 에 의하면 생존률을 100%까지 미분화율 또한 80%이상 향상시킬 수 있다고 보고되었다. 그러나 유리화 동결법은 한 동결 용기에 얼릴 수 있는 hESCs의 세포 덩어리 수가 4~8개 정도에 불과하고, 고농도의 동결 보존제를 사용하므로 안전성에 문제가 있다. 이에 본 연구에서는 비교적 대량으로 보존할 수 있는 프로그램 저속 감온 동결법(programmed slow cooling)에 더하여 단일 세포 상태로 분리된 hESCs의 생존율을 높이는 것으로 알려진 ROCK 억제제(Y27632)를 첨가하여 생존율과 미분화율을 향상시킬 수 있는 가능성을 찾아보고자 하였다. 그 결과 ROCK 억제제에 의하여 세포 생존률(attachment rate: 45.962±25.873%)과 미분화율(undifferentiation rate: 26.505±29.014)을 처리하지 않은 대조군(세포 생존율: 35.194±19.295; 미분화율: 16.845±18.552)에 비해 유의하게 향상시킬 수 있는 것으로 나타났다(p<0.01).
more목차
Table 1. The types of hESC freezing method (summary) 20
Table 2. hESC freezing methods published 21
Table 3. Attachment and undifferentiation Rate 26
Figure 1. Comparison of freezing straw and syringe 22
Figure 2. Comparison of freezing step / thawing step 23
Figure 3. Microscopic images of hESCs frozen-thawed 24
Figure 4. Immuno-fluorescence assay images of hESCs frozen-thawed 25
Figure 5. The effect of Y27632 on survival and self-renewal of hESC during freezing and thawing (≤1 month). 27
Figure 6. The effect of Y27632 on survival and self-renewal of hESC during freezing and thawing (>1 month) 28
(a) 2, 3 and 4 months after freezing 28
(b) 4 months after freezing 29
Figure 7. The effect of Y27632 on survival and self-renewal of hESC during freezing and thawing (overall period) 30
