레트로바이러스를 이용한 사람 간엽 모세포로의 GM-CSF 유전자 전달
초록/요약
연구배경: Mesench ymal stem cell(MSC)은 골화세포, 연골세포, 지방세포, 근육세포 및 신경 세포를 만들 수 있는 다양한 분화능력을 가지고 있으며, 특성상 self-renewal 하는 능력을 가지고 있어 gene therapy에 대한 target으로 새로이 이용되고 있다. 또한 MSC은 대상 환자 의 골수로부터 체외에서 대량 배양이 가능하여 3-4주 동안에 많은 세포를 얻을 수 있다. 이 러한 이유로 MSC을 이용한 gene therapy는 자가 이식이 가능하여 이를 이용한 치료 시 환 자에게 경제적 육체적 부담이 없고, 쉽게 세포를 얻어 사용할 수 있어 다루기 쉽다는 장점과 더불어 많은 혈액성 질환이나 대사성 질환의 치료에 전망 있는 수단으로 필요성이 대두되고 있다. 이로 cytokine stimulation 없이 human MSC에 retrovirus를 이용하여 유전자 조작을 할 때의 optimal condition을 알아보고, transduced MSC에 대한 efficiency가 어느 정도인 지, 즉 다른 세포와 비교할 때 높은 efficiency를 가지는지를 알아보고자 한다. 또 transduced MSC을 long term culture 할 때 일정량 계속해서 gene을 분비하는지 여부에 대해 알아보고, transduced MSC 를 osteablast 로 분화시킬 때 역시 계속해서 일정한 양의 gene이 분비되는지를 알아보고자 한다. 재료 및 방법: human MSC은 hurman bone marrow에서 ficall을 이용해 분리해 낼 수 있다. 좀더 자세히 말하자면, ficall 바로 위의 mononuclear cell을 얻어 plate에 깔고 1주일 incubator에서 배양하면 바닥에 붙어 자라는 cell을 볼 수 있다. 이때 쓰이는 medium은 Duibecco's modified Eagle's medium(DMEM)과 10% Fetal bovine serumo이다. 이렇게 해서 얻은 MSC expand해서 6well에 5×10^4 씩 깔고 confluent한 recombinant retrovirus 의 supernatant로 plate에 infection한다. overnight후 항생제(puromycin)로 infection된 MSC 을 선별한다. transduced MSC은 ELISA로 detection을 한다. transduced MSC도 differentiation 능력을 갖고 있는지, 또 분화된 후에도 gene을 분비하는지 알아보기 위해 morphology 변화 여부와 더불어 osteablast로 분화시켰다. osteoblast로 분화는 dexa, B-glycerophospate, ascorbate 2 phosphate 사용 하였으며 이것 역시 ELISA로 detection 을 한다. transduced MSC은 collagen sponge에 static method와 dynamic method에 의해 collgen 1개당 1×10^5씩 loading한다. collagen sponge는 collagen solutionė freeze-drying 한 후 105°C vacuum oven에 탈수시키고 0.25% glutardialdehyde에 4시간 동안 Crosslink 시킨다. 이 collagen Sponge의 pore sizw는 100um이며 물성은 cell culture 기간동안 유지되는 특성을 갖고 있다. 결과: 인간 골수 내 간협 모세포들은 다양한 종류의 세포들로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있으며 생체 외에서 배양이 가능하고 배양으로 확장된다 하더라도 그 형태나 기능이 안정되게 유지된다. 이들 세포들은 형태적으로 섬유 아세포의 모양을 하고 있으며 생체 외에서 약 33시 간 정도면 2배로 늘릴 수 있고 보고에 의하면 18배까지 확장시켜도 기능이 유지된다. 형질도입 된 사람 간엽 모세포 역시 분화할 수 있는 능력을 가지고 있으며 세포의 표현형도 유지하고 있다. 바이러스의 titer를 결정하기 위해 바이러스가 포함된 상층액을 1/10-1/1000까지 희 석해서 사람 간협 모세포와 NIH-STS 세포에 형질 도입을 해 ELISA로 측정 하였다. 바이러스 titer은 10'이다. PA317 packaging 세포가 생산하는 GM-CSF는 binassay에 의해 측정한 결 과 약 10U/ml이며 NIH-T3 세포에 형질도입 후 생산되는 GM-CSF는 ELISA로 200 ng/ml 이다. 레트로바이러스로 형질도입 된 사람 간엽 모세포로부터 GM-CSF를 측정할 time point 를 결정하기 위해 형질도입 된 사람 간엽 모세포들을 5일 동안 배양하여 day별로 측정하였다. 측정된 결과 3일 째 간엽 모세포에서 GM-CSF 를 가장 많이 분비를 하였고 결과는 NIH-T3 세포에서도 마찬가지이다. 레트로바이러스로 형질 도입 된 사람 간엽 모세포에서 분화 능력에 영향을 미치는지 그리고 분 화된 사람 간협 모세포에서 형질도입 된 유전자가 발현되는지를 결정하기 위해 조골 세포로의 분화능력과 분화 후 전달된 유전자 발현이 유지되는지를 측정 하였다.
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서론 1
재료 및 방법 4
A. 사람 골수로부터의 간엽모세포 분리 및 확장 4
B. 레트로바이러스 구조와 바이러스 생산 4
C. 레트로바이러스를 이용한 사람 간엽 모세포로의 형질도입 4
D. In vitro에서 사람 간엽 모세포의 골 분화 5
E. 생체 활성 물질로의 사람 간엽모세포 접종 6
F. 레트로바이러스로 감염된 사람 간엽모세포에서의 GM-CSF 확인 6
결과 7
A. 형질도입 된 사람 간엽 모세포의 표현형 유지 7
B. 바이러스 생산 7
C. GM-CSG 측정에 대한 Time Point 7
D. 조골 세포로의 분화 후 형질도입된 사람 간엽 모세포 12
E. 사람 간엽 모세포로부터의 전달된 유전자 발현 12
F. 생체활성물질에서의 레트로바이러스로 형질도입 된 사람 간엽 모세포 12
고찰 20
결론 25
참고문헌 26
영문요약 30
