돼지의 beta-casein 유전자의 3' 말단 부위의 cis-acting element가 유선 상피 세포내의 발현에 미치는 영향
Effects of the cis-acting element in the 3'end of porcine beta-casein gene on the expression in mammary epithelial cells
- 주제(키워드) mRNA stability , porcine beta casein gene , luciferase assay
- 주제(KDC) 470
- 주제(DDC) 570
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 민병현
- 발행년도 2007
- 학위수여년월 2007. 8
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 응용생명공학과정
- 본문언어 한국어
초록/요약
형질전환 동물 생산에는, 조직 및 시기 특이적 발현 조절이 가능 하다는 장점 때문에 유즙 내로 외부 유전자를 발현시키는 시스템이 널리 이용되고 있다. 또한, 여러 중소 가축 중, 그 대상 축종으로 많은 산자수 등 여러 가지 장점을 가진 돼지가 많이 이용된다. 유성분 중 30%를 차지하는 beta-casein 유전자의 전사조절인자는 형질전환 동물의 유즙에서 유용 단백질을 생산하는데 주로 이용된다. 단백질의 합성조절은 promoter 활성뿐 만 아니라 mRNA의 안정성에 의해서도 좌우된다. 특히, polyadenylation에 의한 poly(A)의 길이는 in vivo와 in vitro에서 mRNA 안정성에 영향을 주며, 이는 곧 target gene의 변역 효율과 직결된다. 이러한 mRNA 안정성이 목적 유전자의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 3'-UTR 염기서열을 분석하였다. 이 3'-UTR 내의 poly(A) signal을 기준으로 putative cytoplasmic polyadenylation element (CPE) 부위와 downstream elements (DSE: U-rich, G-rich, GU-rich)의 염기서열을 분석하고, 각각의 element를 기준으로 15 종의 luciferase reporter vector를 제작하여, 생쥐 유선 세포주인 HC11과 돼지의 유선 세포인 PMGC에 각각 transfection시킨 후 48시간 동안 배양하고 luciferase 발현량을 분석하였다. 이를 바탕으로 전사 억제제(actinomycin D) 처리 후 시간 변화에 따른 luciferase 발현량 변화를 분석하고, 이를 통해 putative CPE와 DSE의 상관관계가 발현량, 즉 mRNA 안정성에 미치는 영향을 추정하였다. 돼지의 beta-casein 3'-UTR 상의 exon 9에 존재하는 CPE 3와 DSEs만이 결합된 construct (pGL3-PEI-PA#10)가 Act D 처리 후, 가장 높은 발현량을 나타내었으며, mRNA의 안정성에 영향을 주는 요소로 사료된다.
more목차
I. 서론 1
II. 실험의 재료 및 방법
1. 벡터의 구축 5
2. 쥐의 유선세포 배양 5
3. 돼지 유선세포 초기 배양 6
4. Transient transfection 6
5. Hormone induction 7
6. Dual-luciferase reporter assay 8
7. Transfection된 유선 세포에 actinomycin D 처리 8
8. 통계분석 8
III. 실험 결과
1. 돼지 beta-casien 유전자의 5'-UTR과 변형된 3'-UTR을 이용한 luciferase 발현 vector 구축 11
2. 유즙분비호르몬이 유선 상피 세포의 발현량에 미치는 영향 14
3. 제작된15가지 발현 vectors를 유선 상피 세포(HC11, PMGC)에서 transfection 시킨 후 luciferase 발현량의 차이 확인 17
4. 변형된 15가지 발현 vectors를 유선 상피 세포(HC11, PMGC)에 transfection시킨 후 act D를 처리하여 시간 경과에 따른 luciferase 유전자의 발현 변화 확인 19
IV. 결론 및 고찰 25
V. 참고문헌 29
VI. Abstract 35
