bHLH 인자를 이용한 신경전구세포의 운명조절
Regulation of Cell Fates by bHLH Transcription Factors in Neural Progenitor Cells
- 주제(키워드) progenitor , basic helix-loop-helix (bHLH) , P19 cell , neural stem cell (NSC) , Nestin
- 주제(KDC) 513
- 주제(DDC) 616
- 발행기관 아주대학교 일반대학원
- 지도교수 서해영
- 발행년도 2007
- 학위수여년월 2007. 2
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 신경과학기술과정
- 본문언어 영어
초록/요약
포유류의 뇌에는 놀랍도록 다양한 종류의 신경세포가 존재한다. 이 신경세포들의 생성은 몇 가지 발생 단계의 전략을 가지고 진행되는데, 전구세포가 생성될 구역을 설정하고, 시간에 따라 세분화되며, 마침내 분화가 진행된 특정 세포로 바뀌는 것이다. 척추동물의 중추신경계에서 이러한 순차적인 신경세포 혹은 아교세포의 발생은 성장인자와 그 하위 전사인자 간의 복잡한 조절에서 기인한다. 특히 bHLH 구조를 가지는 전사인자는 근육, 혈액, 신경 등 다양한 조직에서 순차적으로 cascade를 이루며 하위 전사인자를 조절하는 것으로 알려져 있다. 신경계의 발생과정에서 또한 신경세포의 결정, 분화 그리고 세분화의 과정이 일련의 bHLH전사인자에 의해 일어나는 것으로 보고되어 있다. 이 논문의 PARTⅠ에서 bHLH전사인자 중 신경발생 결정인자인 Neurogenin1 (Ngn1)이 Nestin의 발현을 증가시켰고, 하나의 세포에서 두 가지 단백질이 동시에 발현하는 것을 배양한 P19 세포와 발생중인 E13.5 생쥐배자의 뇌에서도 관찰하였다. Nestin 두 번째 intron의 3’ 637bp는 Nestin의 신경계 발현을 조절하는데 충분하다고 알려져 있다. 이곳에 존재하는 6개의 E-box (CANNTG) 서열 중 앞의 두 E-box 서열에서 종간 높은 유사성이 관찰되었고 Ngn1의 구조적 표적일 가능성이 높으므로 첫 번째 E-box 서열과 두 번째 E-box 서열을 이용하여 리포터 유전자를 제작하여 분석에 사용하였다. 두 서열 중 두 번째 E-box (1407-1412) 만 Ngn1을 비롯한 Ngn2와 Mash1 등 proneural gene에 특이적으로 활성화 되는 것을 관찰하였고, 돌연변이를 일으킨 리포터의 경우 이러한 활성화가 나타나지 않았다. 또한, 이러한 Ngn1에 의한 Nestin 의 발현조절은 직접결합에 의한 것임을 ChIP assay를 통해 밝혔다. 두 번째 E-box의 단순한 결합의 유무가 아닌, 기능의 중요성을 검증하기 위해 정상 (1407-1412: CAGATG: NE2)이거나 돌연변이(1407-1412: TGGATG: NE2M)인 두 번째 E-box 서열을 포함하는 형질전환생쥐를 제작하였다. 이 형질전환 생쥐는 Nestin 발현부위에서 LacZ를 발현하도록 제작되었다. 정상서열을 포함하는 생쥐는 기존의 보고와 마찬가지로 중추신경계에 강하게 Nestin 유래의 LacZ를 발현하였으나, 돌연변이 E-box를 포함하는 생쥐의 절반은 아예 LacZ의 발현이 관찰되지 않았고, 나머지 절반은 매우 약하고 비정상적인 부위에서 발현하였다. 이것으로 proneural bHLH 전사인자가 두 번째 E-box를 경유하여 Nestin 발현을 조절하는 것을 발견하였다. 이 연구에서 우리는 Nestin 조절이라는 proneural bHLHs의 새로운 기능을 규명하였고, 이는 Nestin 발현을 통한 이른 시기의 신경발생조절 메커니즘에 관한 연구의 기반이 될 것이다. 이 논문의 PARTII에서 Olig2전사인자를 이용하여 oligodendrocyte와 motor neuron의 생성조절기작을 연구하였다. Olig2, 혹은 motor neuron생성에 필요하다고 제시된 바 있는 Ngn2를 P19세포 혹은 NSC에 도입하였다. NSC의 경우, Olig2의 발현이 oligodendrocyte로의 분화를 가장 많이 증가시켰고, Olig2+Ngn2는 motor neuron으로의 분화를 증가시켰으며, 기존에 알려진 바와 같이 Ngn2의 발현은 신경세포로의 분화를 유도하고 아교세포로의 분화를 억제하였다. P19세포의 경우, Olig2의 발현이 motor neuron으로의 분화를 가장 많이 증가시켰고, Olig2+Ngn2는 oligodendrocyte로의 분화를 유도하였다. 신경줄기세포와 P19세포에서 Olig2의 단독발현과 Ngn2와의 동시발현 결과가 바뀐 것은 세포의 context에 따른 차이에서 기인하는 것으로 사료된다. 결론적으로, Olig2와 Ngn2는 oligodendrocyte와 motor neuron의 분화를 유도하고 증진시키는 역할을 하였다. 다분화능을 가진 신경줄기세포는 배자에서 혹은 성체에서 유래하기도 하며, 생성시기가 다르고, 신체 내 생성지역도 다르며 모양 또한 가지각색이다. 신경세포가 여러 기준에 따라 분류되어 있듯, 신경줄기세포 또한 분류하여 목적에 맞게 사용여야 한다. 현재 일관되지 않은 특징을 보이는 신경줄기세포의 표지인자가 몇 종류 알려져 있지만, 더 많은 종류의 표지인자 개발을 통한 신경줄기세포의 분류가 심화되어야 한다. 우리는 이 연구에서 신경세포로의 분화를 유도한 배아줄기세포의 분석을 통해, 52-A11 세포막 표지인자를 획득하였다. 이 단백질의 분석을 위해 Nestin, Sox2, Ki67, Doublecortin (Dcx), CD133 그리고 HuC/D 등의 알려진 신경줄기세포 관련 표지인자를 배양한 신경줄기세포와 발생중인 배자의 중추신경계에서 관찰하였다. 그 결과 52-A11을 발현하는 세포 중 Nestin, Sox2 그리고 Ki67을 동시발현하는 세포가 각각 84.6 %, 84.0 % 그리고 59.2 %로 나타났다. 또한 발생중인 배자의 조직에서 thalamus와 hindbrain을 제외한 대부분의 지역에서 Sox2와 매우 유사한 양상으로 발현되었다. 이 실험을 바탕으로, 52-A11이 신경줄기세포에서 높은 비율로 나타나는 막단백질로 확인되어, 앞으로 신경줄기세포의 세분화나 FACS등 막 표지인자를 이용한 실험에 유용하게 사용될 것으로 사료된다. PART Ⅳ에서는, 배아줄기세포에서 Oct4와 함께 다분화능을 유지시키는 전사인자로 알려져 있는 Nanog와 여러 가지 성장인자나 cytokine을 분비하며, 신호에 반응하여 추적하는 능력이 있는 것으로 알려져 있는 간엽줄기세포 (MSC)를 함께 이용하여 신경줄기세포에 미치는 영향을 조사하였다. Mouse 와 human에서 유래한 간엽줄기세포와 신경줄기세포 모두에서 Nanog 유전자의 도입으로 간엽줄기세포가 신경줄기세포를 oligodendrocyte로 분화시키는 것이 관찰되었다. Stemness 관점에서 Nanog 미미하게 Nestin의 증가를 유도하였다. 배양된 신경줄기세포에서 oligodendrocyte로의 분화가 검증된 MSCnanog 세포를 탈수초 (demyelination) 유도 쥐에 이식하고 2주 후에 SVZ을 관찰, 분석하였다. 그 결과 PBS 주입군 (17.0 %)에 비해 MSC (20.5 %) 혹은 MSC-nanog (20.6 %)를 이식한 모델 쥐에서 BrdU가 조금 증가하였고 Nestin을 발현하는 세포 또한 PBS (6.3 %) 대조군에 비해, MSCnanog (13.7 %) 이식쥐의 경우 두 배 이상 증가함을 관찰하였다. 놀라운 것은 NG2 를 발현하는 oligodendrocyte 전구세포가 4.7 % (PBS) 에서 16.3 % (MSCnanog)로 3 배 이상 증가하였으며 NG2 발현 세포 중 새로이 분열하는 세포 또한 1.1 % (PBS) 에서 8.6 % (MSCnanog)로 8배 가까이 증가함을 관찰하였다. 이 연구의 결과는 다음과 같다. 신경전구세포 특이적인 bHLH 전사인자가 Nestin 유전자의 두 번째 intron에 존재하는 서열 중 두 번째 E-box 서열에 직접 결합함으로써 Nestin의 발현을 조절하였다. Olig2 전사인자는 운명이 결정되지 않은 줄기세포를 oligodendrocyte 혹은 motor neuron으로 분화하도록 조절하였다. 52-A11은 배양된 신경줄기세포뿐 아니라 발생중인 배자의 중추신경계에서, 알려져 있는 신경줄기세포 표지인자인 Nestin, Sox2와 높은 비율의 동시발현을 보여, 새로운 신경줄기세포 표지인자로써의 가능성을 시사하였다. Nanog가 도입된 간엽줄기세포가 배양된 신경줄기세포에서뿐 아니라 탈수초 유도한 질병 쥐에서도 oligodendrocyte의 생성을 유도함을 증명하였다. 이 결과들은 운명이 결정되지 않은 줄기세포의 다분화능을 유지시키거나 neural-lineage의 특정세포분화를 조절하는 기작연구에 기반이 될 것이다.
more초록/요약
The mammalian nervous system exhibits an amazing diversity of cells, including multiple types of neuron, oligodendrocytes and astrocytes. This diversity may be governed by competition between growth factor signaling and downstream transcription factors. Especially, basic helix-loop-helix(bHLH) motif containing transcription factors during the neural development have been known to determine, differentiate and specify the stem／progenitors into subtypes of neurons and glial cells by a cascade signaling. In the PART I, we found that Neurogenein1(Ngn1), a proneural bHLH protein, promote nestin expression in embryonal carcinoma P19 cells and the majority of ngn1 positive cells concomitantly expressed Nestin gene. The coexpression of ngn1 and nestin was observed in developing telencephalic vesicle of E13.5 mouse brain. In addition to Ngn1was formed to bind an E-box in the 2nd intron of the Nestin gene by mutaional analysis and chromatin immunoprecipitaion(ChIP) assay. Ngn2 and Mash1, proneural bHLHs also bind to E-box and E-box mediated Nestin gene expression. Transgenic(Tg) mice containing mutation of the E-box lost Nestin expression in neural stem cells in the developing central nervous system(CNS). These results indicate that proneural bHLH transcription factors promote the Nestin gene expression via binding to the E-box in the second intron. In the PART II, we investigated combinatorial actions of Olig2 and Neurogenin2(Ngn2) in specification of motor neurons and oligodendrocytes using cultured neural stem cells(NSC) and P19 embryonal carcinoma cells. Overexpression of Olig2 induced oligodendrocyte-specific and motor neuron-specific proteins in both NSCs and P19 cells. The data indicate that Olig2 and Ngn2 might be critical for generation of motor neurons and oligodendrocytes from NSCs. In the PART III, we sought for a novel surface antigen. In collaboration with Chun-Jeih Ryu, we found that a monoclonal antibody, 52-A11, could recognize the cells expressing neural precursor markers, including Nestin(84.6 %), Sox2(84.0 %) and Ki67(59.2 %). But not the cells expressed with differentiating neuronal markers such as double cortin(Dcx), and HuC／D. In the PART Ⅳ, in collaboration with Il-Hoan Oh, we investigated that the combinatorial effect of mesenchymal stem cell(MSC) and nanog gene on stem cell properties and cell fate determination of NSCs. MSC transduced with nanog(MSC／nanog) increased NG2 and PLP／DM20 positive cells in primary NSCs. Transplantation of MSC and MSC／nanog cells into the demyelination rat model increased nestin, BrdU, Ki67, NG2 and PDGFRα. The data demonstrate that the nanog transduced MSC potentiates the NSCs to have an oligodendrocytic identity. These results sequentially indicate that PARTⅠ: Ngn1 induces Nestin expression via a second E-box in Nestin second intron. PARTⅡ: Olig2 and Ngn2 promotes differentiation of stem cells into oligodendrocytes and motor neurons. PARTⅢ: 52-A11 cells coexpress Sox2 and Nestin at primary NSC and embryonic brain. PARTⅣ: Nanog transformed MSC increases oligodendrocyte specific expressions in cultured NSCs and demyelinated rat brain. The results suggest that the bHLH transcription factors can play roles in fate determination of neural progenitor cells.
more목차
Ⅰ. INTRODUCTION = 1
Ⅱ. MATERIALS AND METHODS = 9
1. Materials = 9
2. Plasmids = 10
3. Cell culture and reporter gene analysis = 11
4. Electroporation = 15
5. Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) = 16
6. Western analysis = 17
7. Tissue preparation and immunohistochemistry = 17
8. Generation and verification of transgenic mouse = 18
9. Chromatin immunoprecipitation(ChIP) assay = 19
Ⅲ. RESULTS = 22
PARTⅠ. Ngn1 regulates Nestin expression of neural stem cells via a direct interaction of Nestin 2^(nd) intron = 22
PARTⅡ. Olig2 and Ngn2 promote differentiation of stem cells into oligodendrocytes and motor neurons = 53
PARTⅢ. Characterization of 52-A11, a novel marker for a subset of neural stem cells = 72
PARTⅣ. Nanog transformed mesenchymal stem cell promoted oligodendrocyte differentiation of neural stem cells = 84
Ⅳ. DISCUSSION and CONCLUSION = 97
Ⅵ. REFERENCES = 104
국문요약 = 117
