Death receptor5에 대한 유사면역 인간항체 라이브러리의 구축 및 분리된 인간항체의 동정
Development of human scFv antibodies against human death recepto5 from a pseudo-immune library
- 주제(키워드) Yeast surface display+TRAIL+Antibody library
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 김용성
- 발행년도 2006
- 학위수여년월 2006. 8
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 본문언어 한국어
초록/요약
TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL 또는 APO2L)에 의한 Death receptor (DR)-4 및 5의 경로를 통해 활성화되는 세포자멸사 (apoptosis, programmed cell death) 기작은 정상세포에는 부작용이 적고 암세포에 특이적이므로 매우 중요한 암 치료제 개발의 표적 물질로 여겨져 왔다. 본 연구에서는 정상인 60명으로부터 혈액을 채취하여 4가지의 TRAIL 수용체 (DR5, DR4, DcR1, DcR2)에 대한 항체 역가 (titer)를 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)를 통해 분석한 후 DR5 항원에 대해 높은 항체역가를 보이는 혈액 (8명)의 lymphocyte로부터 mRNA를 추출하고 효모표면발현계 (yeast surface display system)을 이용하여 인간 scFv 항체 라이브러리 (size ~ 2×106)를 구축하여 이를 유사면역 라이브러리 (pseudo-immune library)라 명명하였다. 목표 항원인 DR5를 biotinylation한 후Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS, BD FACScallibur)를 이용하여 유사면역 라이브러리로부터 DR5 특이항체를 선별하였다. 선별된 항체는 (HW1~HW6) 비면역라이브러리 (non-immune 또는 naïve library, size ~ 1×109)로부터 같은 항원에 대해 선별된 항체에 비해 (SH1~SH5) 높은 친화도를 보였다. 따라서 유사면역 라이브러리의 구축은 비면역 라이브러리보다 크기가 크지 않더라도 특정 항원에 대해 높은 친화도를 갖는 항체를 선별하는 데 있어 매우 효과적인 전략이라 할 수 있다. 선별된 항체를T7 promoter-pelB periplasmic targeting sequence-scFv-FLAG tag-6His tag으로 디자인된 expression vector pKJ1에 subcloning하여 E. coli BL21(DE3)에서 발현시킨 후 TALON cobalt resin을 이용하여 정제하였다. MTT assay를 이용해 정제된 항체의 다양한 암세포에 대한 cytotoxicity를 평가하였으며 apoptosis에 의한 세포사멸 유무는 FACS analysis (annexin, propidium iodide staining)를 통해 평가하였다. 그 결과 scFv HW1, HW6, SH3가 암세포에 특이적으로 apoptosis를 유발하는 것으로 관찰되었다. 특히 HW1과 HW6는 TRAIL sensitive cancer cell line인 HL60 (human acute myeloid leukemia cell line)와 HCT116 (human colon cancer cell line) 그리고 TRAIL resistant cancer cell line인 HepG2 (human hepatocellular carcinoma cancer cell line) 모두에 apoptosis에 의한 세포사멸을 유도한 반면, SH3는 TRAIL sensitive cancer cell line에서만cytotoxicity를 보였다.
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목 차
List of Tables ⅰ
List of Figures ⅱ
Abbreviation ⅱ
국문요약 ⅳ
Ⅰ.서론 1
1. TRAIL과 TRAIL 수용체 1
2. 항체 의약품 2
3. 효모 표면발현 라이브러리 3
4 유사면역 라이브러리를 이용한 항체 개발 전략 4
Ⅱ. 실험재료 및 방법 13
1. 시료 및 시약 13
2. 실험방법 13
2-1. 정상인 혈액의 각기 항원에 대한 항체 역가 선별 13
2-1-1. 정상인의 혈장과 말초혈액 림프구의 분리 13
2-1-2. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)에 의 한 항체 역가 측정 14
2-2. DR5에 대한 유사면역 인간 항체 라이브러리의 구축 14
2-2-1. first strand cDNA의 합성 14
2-2-2. 항체가변부위 (VH 및 VL)의 유전자 증폭 14
2-2-3. Assembly PCR에 의한 scFv의 제조 15
2-2-4. Yeast homologous recombination을 이용한 형질전환 15
2-3. Pseudo-immune library로부터 FACS를 이용한 항체의 선별 16
2-4. Non-immune library로부터 MACS와 FACS를 이용한 항체의 선별 16
2-5. 선별된 항체의 DR5에 대한 결합친화도의 측정 17
2-6. 선별된 항 DR5 인간 scFv 항체의 발현 및 정제 17
2-7. 선별된 항 DR5 인간 scFv 항체의 다양한 암세포에서의 독성 평가 17
2-7-1. HCT116와 HepG2에서의 세포 독성 평가 18
2-7-2. HL60에서의 세포 독성 평가 18
2-7-3. MTT assay 18
2-7-4. Oligomerization test 18
2-7-5. annexin V 과 Propidium iodide (PI) staining를 통한 apoptotis 조사 19
Ⅲ. 결과 및 고찰 21
1. 항 DR5 유사면역 scFV 라이브러리의 구축 21
1-1. ELISA에 의한 항체 역가 측정 35
1-2. Family gene usage의 분석 21
1-3. 선별 전 라이브러리의 특성 평가 21
2. 유사면역 라이브러리와 비면역 라이브러리로부터 항 DR5 scFv 항체의 선별 27
3. 선별된 scFv 항체의 특성 평가 27
3-1. 선별된 항체의 서열 분석 27
3-2. 선별된 scFv 항체의 DR5에 대한 결합활성 평가 27
3-3. 선별된 scFv 항체의 DR5에 대한 결합 친화도 측정 27
3-4. 선별된 scFv 항체의 발현과 정제 27
3-5. 선별된 scFv 항체의 세포독성 평가 28
3-5-1. HCT116 세포에서의 세포 독성 28
3-5-2. HL60 세포에서의 세포 독성 28
3-5-3. TRAIL-resistant한 HepG2 세포에서의 세포 독성 28
3-5-4. 농도에 따른 세포독성 평가 29
3-5-5. Apoptosis assay 29
Ⅳ. 결론 39
Ⅴ. 참고 문헌 40
Abstract 44
Appendix 45
List of Tables
Table 1. Various formats of antibody therapeutics 8
Table 2. Antibody therapeutics in market 9
Table 3. Preceding researches against death receptors 11
Table 4. V-gene segment usage of the isolated human scFvs against death receptor 5 30
Table 5. IUB code name 48
List of Figures
Figure1. Death receptor dependent and p53-dependent pathway of apoptosis 7
Figure2. Yeast surface display system 10
Figure3. Strategy for development of human antibodies that induce cancer cell specific apoptosis 12
Figure4. Schematic diagrma of the construction of a pseudo - immune human scFv antibody library 20
Figure5. Serum antibody titration level of 8 samples 22
Figure6. Germline gene family usage of VH and VL gene 23
Figure7. Comparison between the pseudo-immune and non - immune human scFv library for repertoire biases 24
Figure8. Comparison between the pseudo-immune and non - immune human scFv antibody library for the enrichment efficiency 26
Figure9. Characterization of representative isolated scFvs for the binding to DR5 31
Figure10. DR5 binding to the isolated scFvs directly on the yeast cell surface 32
Figure11. Purification of scFv antibodies 33
Figure12. Cytotoxicity of purified scFvs on HCT116 cancer cell line 34
Figure13. Cytotoxicity of purified scFvs on HL60 cancer cell line 35
Figure14. Cytotoxicity of purified scFvs on HepG2 cancer cell line 36
Figure15. Concentration dependent cytotoxicity assay 37
Figure16. Apoptosis assay 38
Figure17. PCR reactions for library construction 49
