1년생 고려인삼 뿌리에서의 β-N-ACETYLHEXOSAMINIDASES에 대한 연구
Studies on the β-N-acetylhexosaminidase from one-year-old Korean ginseng (Panax ginseng C.A. Meyer) roots
- 주제(키워드) 인삼 + β-N-ACETYLHEXOSAMINIDASES
- 발행기관 아주대학교
- 지도교수 조 도현
- 발행년도 2006
- 학위수여년월 2006. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 분자과학기술학과
- 본문언어 한국어
초록/요약
인삼은 여러 유용한 물질로 잘 알려져 있다. 그 뿌리의 약리학적 특징은 세포분화와 면역계의 자극, DNA와 프로테인의 합성, 혈액응고 억제 등이다. 또한 고혈당성 질환이나 지방분해 촉진 효과로도 잘 알려져있다. 식물의 β-N-acetyl-hexosaminidase(Hex) (EC 3.2.1.52)는 과실의 성장과 분화에 역할을 하고 당단백질의 분해에도 관여하며 또한 키틴 유래성 물질의 분해에도 관여한다. 대부분의 식물성 hexosaminidase의 연구는 그 뿌리가 아닌 과실과 씨앗에 중점적으로 실시되고 있다. 본 연구는 초기 한국인삼의 chitinase 연구 중에 hexosaminidase의 활성을 확인하고 그 연장선상에서 추가 연구를 통해 hexosaminidase의 분리와 동정을 실시하였고 이후 특징과 효소학적 성질을 알아보았다. 본 연구는 ion exchange chromatography와 hydrophobic chromatography(HIC), Gel filtration을 통하여 hexosaminidase을 분리하고 동정하였다. 분자량과 최적 pH, 최적 온도, Vmax와 Km값등을 확인하였다. 분리된 hexosaminidase 14 fold와 yield는 1.1%를 확인하였다. SDS-PAGE를 통하여 분리된 hexosaminidase를 확인하였고 pI값이 4.7임을 확인하였다. 최적 pH는 5.0이었으며 최적 온도는 30℃로 확인되었다. 기질4MU-GluNAc에 대한 Vmax는 1.383 mmoles/min/mg-protein이었고 Km은 4.13 mM로 확인되었다. 반면에 기질 4MU-GalNAc에 대한 Vmax는 2.20 mmoles/min/mg-protein이고 Km은 7.46 mM로 확인되었다. Gel filtration을 통한 분자량은 70,000 Da 정도로 측정이 되었다.
more목차
List of Tables ⅰ
List of Figures ⅱ
Abbreviation ⅲ
국문요약 ⅳ
Ⅰ. 서론 1
Ⅱ. 실험재료 및 방법 7
1. 실험재료 7
1-1. 시료 7
1-2. 시약 7
1-3. 실험기기 8
2. 실험방법 8
2-1. 조효소액의 제조 8
2-2. 조효소액의 활성 측정 9
2-3. 단백질 정량 방법 9
2-3-1. 단백질 정량 9
2-4. 전기영동 10
2-4-1. SDS-PAGE 10
2-4-2. Silver staining 11
2-5. 효소의 분리 정제 12
2-5-1. 음이온 교환수지법 12
2-5-2. 양이온 교환수지법 12
2-5-3. Hydrophobic interaction chromatography 13
2-5-4. Sephadex G-200을 이용한 Size exclusion chromatography에 의한 분리 13
2-5-5. Mono-P를 통한 pI확인 14
2-6. 순수 분리된 효소 특성 14
2-6-1. 분자량 측정 14
2-6-2. 최적 pH, 온도 15
2-6-3. pH 안전성과 열 안전성 15
2-6-4. Km 및 Vmax 16
2-6-5. 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-Glucosaminide 를 이용한 기질 특이성 확인 16
Ⅲ. 결과 및 고찰 17
1. 인삼의 각 부위별 헥소자민 효소의 합성 17
1-1. 인삼의 각 부위별 헥소자민 효소의 활성 비교 17
2. 1년생 고려인삼 주근에서의 헥소자민 효소의 정제 19
2-1. 음이온 교환수지법에 의한 정제 19
2-2. 이차 음이온 교환수지법에 의한 정제 19
2-3. Hydrophobic interaction chromatography에 의한 2QF1의 정제 22
2-4. Sephadex G-200을 이용한 Size exclusion chromatography에 의한 분리 22
3. 1년생 고려인삼 뇌두에서의 헥소자민 효소의 정제 25
3-1. 음이온 교환수지법에 의한 정제 25
3-2. 이차 음이온 교환수지법에 의한 정제 25
3-3. Hydrophobic interaction chromatography에 의한 2QF1의 정제 28
3-4. Sephadex G-200을 이용한 Size exclusion chromatography에 의한 분리 28
4. 정제된 효소 주근 Main roots fraction(MGF) 와 Rhizomes fraction(RGF)의 효소학적 특성 33
4-1. 반응시간의 영향 33
4-2. 활성에 미치는 pH의 영향 33
4-3. 활성에 미치는 온도의 영향 37
4-4. 냉동, 냉장, 실온보관을 통한 Main roots 효소의 안전성 시험 38
4-5. 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-Glucosaminide 를 이용한 Main roots와 Rhizomes의 기질 특이성 확인 40
4-6. 분리된 MGF와 RGF의 Mono-P를 통한 pI값 확인 40
4-7. Km 및 Vmax의 결정 43
Ⅳ. 결 과 46
Ⅴ. 참고 문헌 47
Abstract 54
